材料

时间:2022-02-27 13:56:41 来源:网友投稿

窗体顶端 准备材料与实验方法 1.1载体与菌株 (1)载体:pMD18-T载体购于TaKaRa公司。pcDNA3.1+载体购于Invitrogen公司。其中pcDNA3.1+的载体结构如图所示  (2)大肠杆菌菌株(用于克隆):DH5α,购于 TransGen 公司。  (3)细胞系:采用人羊膜上皮细胞(WISH 细胞),来源于本试验室的冻存细胞。

1.2 PCR新增产物的检测和回收  将5μL标准分子量的DNA Marker DL2000作为参考,所以首先需取1.5%的琼脂糖凝胶用来检验并测试PCR扩增所产生的物质,其次将5 μL的生成物质全部加入凝胶孔内。随后需要将凝胶孔内物质进行电泳,需要的电流是200mA,电压是200V,结束后应将凝胶孔内的成像结果进行观察并进行拍摄记录。此次实验需要在室内常温下进行,该实验方法对各种浓度回收中的琼脂糖凝胶60bp-20kb的DNA片段都有一定的实用。

琼脂糖凝胶回收:参考Omerga胶回收试剂盒说明书 1.3构建表达载体和酶切回收 1.3.1pMD18-T载体连接与转化 将回收的PCR产物连入pMD18-T载体上,根据说明书进行操作 1.3.2质粒的提取 连接pMD18-T,其中质粒小量的提取可以参考Omega公司的质粒小提试剂盒 1.3.3重组表达质粒的构建 将载体,即pMD18-T和pcDNA3.1+,进行双酶切,其中很关键的是该载体需要含有质粒。

1.3.4提取去内毒素和表达质粒的重组 参考Omega公司的Endo-free Plasmid Mini Kit II(D6950-01)的说明书进行。内毒素的提取和重组。

1.4细胞培养 (1)首先需将细胞进行复苏 (2)对细胞进行培养,培养的过程只需常规操作进行培养 (3)将培养后的细胞冻存即可 1.5细胞转染 此次实验在细胞培养之后需将细胞进行转染 转染操作参考:Life Technologies 公司的LipofectamineTM  3000和Invitrogen公司的RNAiMAX 1.6提取细胞总RNA 在提取细胞RNA的过程需参考 Omega 的 RNA 提取说明书。

1.7实时荧光定量分析 在提取RNA后,需要将其测定浓度,并将其进行电泳检测,目的是检测质量是否合格,合格状态应是提取后的RNA仅有两条带,分别是28S和18S,并且18S的亮度应是28S亮度的一半。随后进行反转录操作(参考依据:Thermo Scientific反转录试剂盒)。

1.8 Western Blot实验步骤 (1)首先提取蛋白 (2)使用SDS-PAGE试剂进行电泳  (3)将其进行转模 (4)观察抗原抗体发生免疫反应 1.9ELISA 使用17β-Estradiol EIA kit试剂盒对收集的细胞上清进行ELISA分析 1.10免疫组化过程 1.10.1石蜡切片的免疫组化实验步骤 (1)将石蜡切片并脱蜡至水 (2)进行抗原修复 (3)切断内源性过氧化物酶 (4)使血清或BSA处于封闭 (5)加入一抗 (6)加入二抗 (7)DAB显色 (8)将细胞核复染 (9)将封片进行脱水处理 (10)使用显微镜进行镜检,随后对图像数据收集分析。

1.11 活体实验的实施方案 (1)首先将试验分为5组,包括:PFT-μ 组、LPS 组、PFT-μ-LPS 组以及DMSO对照组和PBS对照组 注意:由于DMSO和PB分别属于PFT-μ和LPS的溶剂,所以实验中需要采用两个对照组 (2)将雄性鼠和雌性鼠放入同一个笼子后,第二天将带有阴道栓的雌鼠妊娠天数记录为0,随后将其随机分为组,每组放入6只 当雌鼠妊娠15天时,分别将它们进行DMSO、PFT-μ、LPS 和 PBS的注射。在妊娠 15 天时,将PFT-μ-LPS组,首先注射 PFT-μ,大约1 h过后再对其注射 LPS。两次的量分别为:DMSO: 100 μL; PFT-μ: 1 mg/只,浓度为 10 mg/mL 的 PFT-μ 注射 100 μL; LPS: 50 μg/只,浓度为0.5 mg/mL 的 LPS 注射 100 μL; PBS: 100 μL。  将雌鼠腹腔内注射各试剂,并在6h内第一只胎儿鼠分娩时,需要收集各组的胎膜。

1.12统计学分析 本实验通过建立试验组和对照组进行探究,并使用SPSS16.0和SAS进行单因素的方差进行分析同时带有显著性检验,产生的结果均已均值±标准误表示。其中差异显著使用*表示,即p<0.05,差异极显著使用**表示,即p<0.01 窗体底端

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